RINGKASAN
Novizar, Joko Sulistyo, dan Norman Ferdinal: BIOPROSES ENZIMATIK FLAVONOID-GLIKOSIDA DARI EKSTRAK GAMBIR (Uncaria gambir Roxb) dan UJI AKTIVITASNYA SEBAGAI ANTIOKSIDAN DAN ANTIMIKROBA
Gambir Uncaria gambir (Hunter) Roxb merupakan komoditi unggulan Sumatera Barat yang potensial karena memiliki nilai ekonomi tinggi dan multi guna. Gambir mengandung flavonoid yang merupakan bahan baku untuk pembuatan obat-obatan anti-hepatitis B, anti-diare (Dharma 1985), penghambat pembentukan plak gigi (Kozai et al. 1995. cit. Nazir 2000), antimikroba, antinematoda (Alen, Bakhtiar, Noviantri 2004) dan manfaat lainnya dalam mendukung berbagai industri farmasi, kosmetik, dan pertanian (Nazir, 2000).
Menurut Nazir (2000), Indonesia merupakan satu-satunya eksportir gambir utama dunia dimana hampir 80% gambir yang dihasilkan Indonesia diekspor ke luar negeri, terutama India. Kondisi saat ini menunjukkan kecenderungan bahwa harga komoditas gambir ini masih ditentukan oleh pasar luar negeri dengan fluktuasi harga gambir mencapai 400% (Linkeinheil, 1998).
Walaupun gambir sudah lama diperdagangkan, akan tetapi teknologi pengolahannya masih sederhana, gambir masih dijual dalam bentuk "gambir mentah". Posisi tawar menawar (bargaining power) petani kita masih rendah. Menurut Linkenheil (1998) harga gambir yang dinikmati petani jauh lebih rendah dibandingkan harga yang berlaku di pasaran international.
Kondisi ini tidak dapat dibiarkan berlangsung terus menerus. Maka dari itu diversifikasi produk gambir dan pemanfaatannya mutlak dilakukan. Salah satu upaya adalah membuat sediaan senyawa flavonoid dari gambir untuk dimanfaatkan sebagai antioksidan dan antimikroba.
Walaupun demikian, senyawa flavonoid mempunyai kelemahan. Flavonoid umumnya memiliki kelarutan yang rendah serta tidak stabil terhadap pengaruh cahaya, oksidasi dan perubahan kimia. Karena itu, apabila teroksidasi, strukturnya akan berubah dan fungsinya sebagai bahan aktif akan berkurang dan bahkan hilang (Kitao dan Sekine, 1994).
Salah satu cara meningkatkan kelarutan dan kestabilan senyawa flavonoid ialah dengan mengubah senyawa tersebut menjadi bentuk glikosida yaitu flavonoid-glikosida (flavonoid dengan gula terikat) melalui reaksi transglikosilasi, baik secara kimiawi maupun secara enzimatis dengan bantuan enzim transferase (CG-Tase) (Kometani et al 1996).
Tujuan khusus penelitian ini adalah melakukan sintesis flavonoid glikosida dari 4 jenis tanaman gambir (Uncaria gambir Roxb.) yang tumbuh di Sumatera Barat (Lampiran 1) menggunakan sumber biakan Aspergillus oryzae, Actinomycetes dan Bacillus licheniformis untuk dimanfaatkan sebagai antioksidan dan antimikroba. Tujuan kedua adalah untuk mengetahui variasi fitokimia dan kandungan flavonoid dari empat tipe gambir Sumatera Barat dan aktivitas transfer flavonoidnya.
Gambir diekstrak menggunakan dua metode ekstraksi: metode A dan Metode B. Metode A merupakan modifikasi, dimana ekstrak gambir dibekukan dulu sebelum diendapkan dan dikeringkan. Metode A lebih baik daripada Metode B pada keseluruhan tipe gambir. Hasil penelitian juga menunjukkan terdapat variasi rendemen gambir dari 4 tipe gambir Sumatera Barat. Variasi rendemen gambir disebabkan oleh variasi genetik dari empat tipe gambir tersebut (Fauza 2007), Nazir dan Yusniwati (2002). Banyak faktor yang menyebabkan variasi rendemen gambir, diantaranya faktor genetik, cara dan kondisi pengolahan, kondisi tempat tumbuh, faktor pasca panen (Nazir 2000).
Dari hasil analisis kualitatif menujukkan bahwa gambir mengandung quinon, terpenoid, alkaloid, tannin, flavonoid dan saponin (Thorpe dan Whiteley 1921, Bakhtiar 1991 dan Nazir 2000). Sementara itu steroid tidak terdeteksi pada keseluruhan tipe gambir Alkaloid yang terbesar terdapat pada gambir tipe udang.
Ada 3 pelarut yang digunakan dalam ekstraksi gambir: chloroform, etil asetat dan butanol. Hasil penelitian menunjukkan bahwa terdapat variasi kandungan flavonoid dari gambir berdasar jenis pelarutnya dan berdasarkan tipe gambirnya. Kandungan flavonoid yang paling tinggi ada pada gambir tipe Riau Gadang. Variasi tersebut terjadi diduga karena adanya variasi genetik dari gambir (Fauza 2007) dan adanya variasi anatomis (Nazir dan Yusniwati 2002).
Penelitian ini juga mempelajari aktivitas transglikosilasi CGT-ase dari berbagai sumber biakan. Dalam penelitian ini sumber biakan adalah Actinomycetes (Strain 23.2, Strain 25.5 dan Strain W 32), B. Licheniformis dan A. Oryzae. Yang terlihat aktif sebagai enzim transfer adalah B. Licheniformis dan Actinomycetes Strain 23.2, dan Strain W 32 (buffer fosfat). Sementara itu CGT-ase dari biakan A. Oryzae tidak memperlihatkan potensi aktif sebagai enzim transferase.
Aktivitas enzim CGT-ase sangat dipengaruhi oleh pH dan suhu agar aktivitasnya optimal, tetapi enzim ini akan kehilangan aktivitasnya akibat panas. Berdasarkan uji yang dilakukan diperoleh bahwa aktivitasnya akan menurun dengan meningkatnya suhu dan pH. Aktivitas tidak akan meningkat lagi setelah pH >9 (Sulistyo et al 1998, Handayani et al 2002 dan 2005).
Dari hasil penelitian menunjukkan bahwa enzim CGT-ase dari biakan Actinomycetes dan B. Licheniformis dengan donor glikosil berasal dari isomalto dan pati terlarut komersial dan akseptor ekstrak flvonoid (fraksi atil asetat dan butanol) pada sistem reaksi dua lapisan mempunyai aktivitas transfer gugus glukosil yang tinggi. Penentuan konsentrasi produk transfer yang diperoleh dilakukan dengan metode Dubois dengan standar arbutin. Kandungan gula produk transfer berkisar antara 672.2 ppm – 2104.8 ppm bergantung kepada tipe gambir dan donor glukosilnya. Hasil penelitian menunjukkan donor glikosil isomalto terlihat lebih baik daripada pati terlarut komersial.
Pada membuktikan aktivitas transfer dalam penelitian ini dilakukan uji aktivitas transfer CGT-ase dari biakan B. licheniformis yang dapat mentransferkan gugus glukosil pada akseptor pyrocatechol dan resorsinol dan flavonoid dari gambir fraksi etil asetat menggunakan iso-malto sebagai donor glikosil. Hasil produk flavonoid-a-glikosida, pyrocatechol-a-glikosida dan resorsinol-a-glikosida yang terbentuk diidentifikasi dengan KLT. Fasa diam yang digunakan dalam KLT adalah silika yang bersifat polar, sedangkan fase geraknya adalah larutan pengembang, terdiri dari propanol dan air dengan perbandingan (85 : 15). Senyawa non polar akan tertahan dengan nilai Rf yang rendah. Senyawa yang banyak memiliki gugus hidroksil akan bersifat polar, sehingga nilai Rf-nya akan lebih rendah. Akseptor yang digunakan berasal dari senyawaan fenol karena senyawa ini cenderung larut dalam air dan sering bergabung dengan gula glukosida yang memiliki gugus –OH dan tidak bersifat sebagai substrat enzim yang dapat menghambat aktivitas enzim CGT-ase.
Nilai Rf produk merupakan perbandingan antara jarak spot produk yang terbentuk dibagi jarak pelarut. Hasil dari uji aktivitas transfer flavonoid dari gambir fraksi Etil asetat menunjukkan bahwa Nilai Rf dari produk transfer hampir sama dengan Rf dari standar arbutin. Hasil KLT menunjukkan adanya produk transfer untuk fase organik/alkohol (lapisan atas) untuk semua Gambir enzim alpha -amiloglukosidase 0,005%, sementara pada fase air produk transfer tidak terlihat.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa terdapat variabilitas phytokimia dan kandungan flavonoid diantara empat tipe gambir, dimana Riau gadang memiliki kandungan flavonoid yang tinggi, sementara kandungan alkaloid tertinggi terdapat pada Gambir Udang Enzim CGT-ase dari Aspergillus oryzae tidak dapat digunakan untuk mensintesis senyawa flavonoid-a-glikosida, sementara enzim CGT-ase dari Actinomycetes (Strain W 25.3 dan W 32) dan B. Licheniformis (buffer fosfat) berpotensi aktif sebagai enzim transferase. Hasil KLT menunjukkan adanya produk transfer untuk fase organik/alkohol (lapisan atas) untuk semua Gambir enzim alpha -amiloglukosidase 0,005%, sementara pada fase air produk transfer tidak terlihat. Nilai Rf dari produk transfer hampir sama dengan Rf dari standar arbutin. Kandungan gula produk transfer yang ditentukan dengan Metode Dubois berkisar antara 672.2 ppm – 2104.8 ppm bergantung kepada tipe gambir dan donor glukosilnya. Flavonoid dari semua tipe gambir (fraksi etil asetat dan butanol) bisa dijadikan produk transfer, dilihat dari kandungan gulanya. Hasil penelitian menunjukkan donor glikosil isomalto terlihat lebih baik daripada pati terlarut komersial.
Pengujian aktivitas enzim CGT-ase dilakukan dengan menggunakan pati sebagai substrat. Kemampuan menghidrolisis pati diuji dengan menambahkan KI dalam I2 sehingga terbentuk larutan yang berwarna biru. Intensitas warna biru sebanding dengan konsentrasi pati yang tidak terhidrolisis, sehingga semakin banyak pati yang terhidrolisis, warna biru akan memudar. Hasil uji pengaruh suhu dan pH terhadap aktivitas enzim menunjukkan bahwa CGT-ase dari Actinomycetes dan B. lichenifirmis mempunyai kemampuan optimum pada suhu 40°C (8,87 unit/mL) dan pH 6,5 (8,89 unit/mL ), dapat dilihat pada Gambar 5 dan 6.
